微生物檢驗(yàn)的基本操作技術(shù)匯總！

無菌操作基礎(chǔ)知識(shí)

一、無菌操作技術(shù)

1、定義　

是指在執(zhí)行實(shí)驗(yàn)過程中，防止一切微生物侵入機(jī)體和保持無菌物品及無菌區(qū)域不被污染的操作技術(shù)和管理方法；

無菌操作技術(shù)是微生物實(shí)驗(yàn)的基本技術(shù)，是保證微生物實(shí)驗(yàn)和順利完成的重要環(huán)節(jié)。

2、內(nèi)容

無菌操作技術(shù)主要包括兩方面：

1）創(chuàng)造無菌的培養(yǎng)環(huán)境。包括密閉的培養(yǎng)容器、培養(yǎng)容器的滅菌、培養(yǎng)基的滅菌等；

2）在操作和培養(yǎng)過程中防止一切其它微生物的侵入的措施。包括紫外線殺菌、甲醛熏蒸、凈臺(tái)的消毒與檢測(cè)、操作工具、器皿滅菌、操作方法等。

3、無菌操作原則

1）在執(zhí)行無菌操作時(shí)，必須明確物品的無菌區(qū)和非無菌區(qū)，接種時(shí)必須穿工作服、戴工作帽，應(yīng)在進(jìn)無菌室前用肥皂洗手，然后用75%酒精棉球?qū)⑹植粮蓛簦?/span>

2）在操作前20～30分鐘要先啟動(dòng)凈臺(tái)和紫外燈，進(jìn)行接種所用的吸管、平皿及培養(yǎng)基等必須經(jīng)消毒滅菌，打開包裝未使用完的器皿，不能放置后再使用，金屬用具應(yīng)高壓滅菌或用95%酒精點(diǎn)燃燒灼3次后使用。嚴(yán)禁用手直接拿無菌物品，如瓶塞等，而必須用消毒的鉗、鑷子等；

3）從包裝中取出吸管時(shí)，吸管尖部不能觸及外露部位，使用吸管接種于試管或平皿時(shí)，吸管尖不能觸及試管或平皿邊；

4）接種樣品、轉(zhuǎn)種細(xì)菌必須在酒精燈前操作，接種細(xì)菌或樣品時(shí)，吸管從包裝中取出后及打開試管塞都要通過火焰消毒；

5）接種環(huán)或接種針在接種細(xì)菌前應(yīng)經(jīng)火焰燒灼全部金屬絲，必須時(shí)還要燒到環(huán)和針與桿的連接處；

6）吸管吸取菌液或樣品時(shí)，應(yīng)用相應(yīng)的橡皮頭吸取，不得直接用口吸。傾倒平板應(yīng)在凈臺(tái)內(nèi)操作，并且在開啟和加蓋瓶塞時(shí)需反復(fù)用酒精燈燒。

二、無菌操作的環(huán)境要求

1、無菌室

（1）無菌室的結(jié)構(gòu)：更衣間、緩沖間、操作間；

（2）無菌室的消毒和防污染

?每日（使用前）紫外線照射（0.5~1小時(shí)）；

?每月用新潔爾滅擦拭地面和墻壁一次的方式進(jìn)行消毒；

?每季度用甲醛、乳酸、過氧乙酸熏蒸（2小時(shí)），特殊情況下可增加熏蒸頻次。

（3）無菌室使用要求

①無菌室內(nèi)應(yīng)保持清潔，工作后用2%-3%煤酚皂溶液消毒，拭擦工作臺(tái)面，不得存放與實(shí)驗(yàn)無關(guān)的物品；

②無菌室使用前后應(yīng)將門關(guān)緊，打開紫外線，如采用室內(nèi)懸吊紫外燈消毒時(shí)，需30W紫外燈，距離在1.0m處，照射時(shí)間不少于30min，使用紫外燈，應(yīng)注意不得直接在紫外線下操作，以免引起損傷，燈管每隔兩周需用酒精棉球輕輕拭擦，除去上面灰塵和油垢，以減少紫外線穿透的影響；

③處理和接種食品標(biāo)本時(shí)，進(jìn)入無菌室操作，不得隨意出入，如需要傳遞物品，可通過小窗傳遞。在無菌室內(nèi)如需要安裝空調(diào)時(shí)，則應(yīng)有過濾裝置。

2、凈工作臺(tái)

凈臺(tái)的使用與保養(yǎng)：

（1）風(fēng)速穩(wěn)定，且符合要求；

（2）使用前開啟紫外燈照射30分鐘以上；

（3）讓凈臺(tái)預(yù)工作10－15分鐘；

（4）使用完畢后，用70%酒精將臺(tái)面和臺(tái)內(nèi)四周擦拭干凈。

3、無菌器材

（1）滅菌器材：玻璃器皿、培養(yǎng)基、無菌衣等；

（2）消毒器材：無菌室內(nèi)的凳子、試管架、天平、工作臺(tái)、手等。

（3）無菌間一般只允許放置無菌操作臺(tái)、轉(zhuǎn)椅等物品；無菌操作臺(tái)上一般只允許擺放以下物品： 酒精燈、打火機(jī)、接種針、消毒棉球、洗耳球、鑷子、油性筆、滅菌平皿、試管架、滅菌吸管、電子天平、250ml滅菌三角瓶、培養(yǎng)基、均質(zhì)器等。

三、無菌操作的基本技術(shù)

1、無菌接種操作

培養(yǎng)基經(jīng)高壓滅菌后，用經(jīng)過滅菌的工具（如接種針和吸管等）在無菌條件下接種含菌材料（如樣品、菌苔或菌懸液等）于培養(yǎng)基上，這個(gè)過程叫做無菌接種操作。

在實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)中的各種接種必須是無菌操作。

2、微生物檢驗(yàn)過程中的無菌操作要求

（1）在操作中不應(yīng)有大幅度或快速的動(dòng)作；

（2）使用玻璃器皿應(yīng)輕取輕放；

（3）在正火焰上方操作；

（4）接種用具在使用前、后都必須灼燒滅菌；

（5）在接種培養(yǎng)物時(shí)，協(xié)作應(yīng)輕、準(zhǔn)；

（6）不能用嘴直接吸吹吸管；

（7）帶有菌液的吸管、玻片等器材應(yīng)及時(shí)置于盛有5%來蘇爾溶液的消毒桶內(nèi)消毒。

3、無菌操作技術(shù)詳細(xì)圖解

（1）取菌技巧

（2）接種技巧

（3）錯(cuò)誤示范

微生物的接種、分離純化和培養(yǎng)技術(shù)

一、接種

1、接種定義

接種：將微生物接到適于它生長(zhǎng)繁殖的人工培養(yǎng)基上或活的生物體內(nèi)的過程叫做接種。

2、接種工具

在實(shí)驗(yàn)室中，用得zui多的接種工具是接種環(huán)、接種針。有時(shí)滴管、吸管也可作為接種工具進(jìn)行液體接種。在固體培養(yǎng)基表面要將菌液均勻涂布時(shí)，需要用到涂布棒。

1．接種針 2.接種環(huán) 3.接種鉤 4.5.玻璃涂棒 6.接種圈 7.接種鋤 8.小解剖刀

3、微生物檢驗(yàn)常見接種方法

（1）劃線接種法

平板劃線分離法--分區(qū)劃線分離法

①用接種環(huán)先將培養(yǎng)物涂布于平板1區(qū)并作數(shù)次劃線，再在2、3&#823&#823區(qū)依次劃線；

②每劃完一個(gè)區(qū)域，轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿約70度角，并將接種環(huán)滅菌一次，待冷后再劃下一區(qū)域；

③每一區(qū)域的劃線均接觸上一區(qū)域的接種線1～2次，使接種量逐漸減少，以獲得單個(gè)菌落；

④其他操作與上述曲線劃線分離法相同。

（2）斜面接種法

主要用于經(jīng)劃線分離培養(yǎng)所獲得的單個(gè)菌落的移種，以及觀察細(xì)菌的某些培養(yǎng)特征。

以菌種移種為例，其接種方法是：

①取一菌種管和培養(yǎng)基管，置左手食指、中指、無名指間，拇指壓住兩管底部上側(cè)面，使菌種管位于外側(cè)，培養(yǎng)基管位于內(nèi)側(cè)；

②右手拇指和食指分別旋松兩管棉塞?；鹧鏈缇臃N環(huán)；

③以右手小指與手掌，小指與無名指分別夾取棉塞（先外管后內(nèi)管），將兩管口迅速通過火焰1~2次；

④將已滅菌的接種環(huán)伸入菌種管中，從斜面上取菌少許，迅速伸入待接種的培養(yǎng)基管中，在斜面底部向上劃一條直線，然后從底部起向上作曲折連續(xù)劃線，直至斜面上方頂端；

⑤取出接種環(huán)，火焰滅菌管口，塞上棉塞（先塞內(nèi)管）；zui后將接種環(huán)經(jīng)火焰滅菌放好；

⑥做好標(biāo)識(shí)，置35℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18~24小時(shí)。斜面培養(yǎng)一般形成均勻一致的菌苔。一般可觀察表面、透明度、色澤等特征。

（3）涂布接種法

涂布法接種是一種常用的接種方法，不僅可以用于計(jì)算活菌數(shù)，還可以利用其在平板表面生長(zhǎng)形成菌苔的特點(diǎn)用于檢測(cè)化學(xué)因素對(duì)微生物的抑殺效應(yīng)。

原理：將一定濃度，一定量的待分離菌液移到已凝固的培養(yǎng)基平板上，再用涂布棒快速地將其均勻涂布，使長(zhǎng)出單菌落而達(dá)到分離的目的。

（4）液體接種法（肉湯接種）

①如斜面接種法持好菌種管及培養(yǎng)基管；

②滅菌接種環(huán)，從菌種管取菌，伸入培養(yǎng)基管中，在接近液面的管壁上方輕輕研磨，并沾取少許培養(yǎng)基液體調(diào)和，使細(xì)菌混合于培養(yǎng)基的液體中。液體培養(yǎng)基一般以18~24小時(shí)培養(yǎng)后觀察生長(zhǎng)特征。

肉湯培養(yǎng)可觀察如下幾項(xiàng)：

a.發(fā)育程度：有無生長(zhǎng)、微弱、中等、旺盛；

b.混濁度：有無及程度（混、中等、微混、透明）、均勻混濁、有顆粒、絮狀生長(zhǎng)；

c.沉淀：有無及量多少、性狀（粉狀、顆粒狀、絮狀、沾性）；

d.表面：有無生長(zhǎng)、性狀（膜狀、環(huán)狀）、菌膜厚薄及表面特征（光滑、顆粒、皺狀）；

e.其他：有無特殊氣味，色素。如果是糖發(fā)酵培養(yǎng)基則主要觀察是否產(chǎn)酸和有無氣體。

（5）穿刺接種法（半固體接種）

多用于保存菌種、觀察動(dòng)力及厭氧培養(yǎng)等也可以用于觀察細(xì)菌的某些生化反應(yīng)。

①如斜面接種法持好菌種管及培養(yǎng)基管；

②以滅菌接種針從菌種管取菌，垂直刺入培養(yǎng)基的中心（半固體或一般瓊脂高層）直達(dá)近管底部（但不能刺到管底），接種針應(yīng)沿原路退出；

③經(jīng)培養(yǎng)后半固體培養(yǎng)基可觀察到：沿穿刺線生長(zhǎng)，線外的培養(yǎng)基清亮表示細(xì)菌無動(dòng)力；穿刺線模糊不清，或沿穿刺線向外擴(kuò)散生長(zhǎng)，或整個(gè)培養(yǎng)基混濁表示細(xì)菌有動(dòng)力。

二、分離純化

1、幾個(gè)定義

混和培養(yǎng)物：含有一種以上的微生物培養(yǎng)物稱為混和培養(yǎng)物（Mixed culture）；

純培養(yǎng)：如果在一個(gè)菌落中所有細(xì)胞均來自于一個(gè)親代細(xì)胞，那么這個(gè)菌落稱為純培養(yǎng)（Pure culture）；

分離純化：在進(jìn)行菌種鑒定時(shí)，所用的微生物一般均要求為純的培養(yǎng)物，得到純培養(yǎng)的過程稱為分離純化。包括傾注平板法、涂布平板法、平板劃線法等等。

2、傾注平板法（倒平板）

將無菌培養(yǎng)皿放入生物安全柜或凈化臺(tái)中，然后分別倒入15ml已融化并且冷卻至45℃左右的牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基，加蓋后輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)皿，使培養(yǎng)基均勻分布，待凝固之后，把這平板倒置在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。單一細(xì)胞經(jīng)過多次增殖后形成一個(gè)菌落，取單個(gè)菌落制成懸液，重復(fù)上述步驟數(shù)次，便可得到純培養(yǎng)物。整個(gè)操作過程應(yīng)嚴(yán)格按照無菌操作。

三、微生物的培養(yǎng)方法

微生物的生長(zhǎng)，除了受本身的遺傳特性決定外，還受到許多外界因素的影響，如營(yíng)養(yǎng)物濃度、溫度、水分、氧氣、pＨ等。微生物的種類不同，培養(yǎng)的方式和條件也不盡相同。通常分為：

1、一般培養(yǎng)法（需氧培養(yǎng)）    

培養(yǎng)溫度：25~37℃ 。

2、厭氧培養(yǎng)方法

（1）簡(jiǎn)易的厭氧培養(yǎng)法：

A、庖肉培養(yǎng)法

B、鐵絲圈厭氧培養(yǎng)法

C、焦性沒食子酸法

（2）厭氧罐法

（3）厭氧手套箱法

厭氧缸法：

厭氧缸是普通的干燥缸，用物理化學(xué)的方法使缸內(nèi)造成厭氧環(huán)境，從而將厭氧菌培養(yǎng)出來。

接種好標(biāo)本的平板或液體培養(yǎng)基試管，可放入?yún)捬醺變?nèi)培養(yǎng)。

厭氧罐法：

裝入待培養(yǎng)的對(duì)象，然后密閉罐蓋，接著可采用抽真空&#8594灌氮&#8594抽真空&#8594灌氮&#8594抽真空&#8594灌混合氣（N2∶CO2∶H2=80∶10∶10，V/V）。

3、二氧化碳培養(yǎng)法

（1）燭缸法

（2）二氧化碳置換法

（3）化學(xué)法

每一升用重碳酸鈉0.4克與濃鹽酸0.35亳升加入。

（4）二氧化碳培養(yǎng)箱法

四、微生物常規(guī)鑒定技術(shù)

1、形態(tài)結(jié)構(gòu)和培養(yǎng)特性觀察

（1）在固體培養(yǎng)基上，觀察：

菌落大小、形態(tài)、顏色（色素是水溶性還是脂溶性）、光澤度、透明度、質(zhì)地、隆起形狀、邊緣特征及遷移性等；

（2）在液體培養(yǎng)中：

表面生長(zhǎng)情況（菌膜、環(huán)）混濁度及沉淀等；

（3）半固體培養(yǎng)基穿刺接種：

觀察運(yùn)動(dòng)、擴(kuò)散情況。

2、染色鏡檢

（1）染色原理

由于微生物細(xì)胞含有大量水分，機(jī)體是無色透明的，與周圍背景沒有明顯的反差， 必須進(jìn)行染色，使經(jīng)染色后的菌體與背景形成明顯的色差，從而能更清楚地觀察到其形態(tài)和結(jié)構(gòu)。

微生物中細(xì)菌、致病菌是很小的生物體，必須通過染色的方法，在顯微鏡下才能看得清楚，并且還可以通過染色的方法鑒別革蘭氏染色特性，以及是否長(zhǎng)有鞭毛、周毛、莢膜和芽孢等。

（2）染色方法

①簡(jiǎn)單染色法

簡(jiǎn)單染色法又叫作普通染色法，只用一種染料使細(xì)菌染上顏色，觀察細(xì)菌的形態(tài)。

②復(fù)染色法

用兩種或多種染料染細(xì)菌，目的是為了鑒別不同性質(zhì)的細(xì)菌，所以又叫鑒別染色法。主要的復(fù)染色法有革蘭氏染色法和抗酸性染色法。

（3）革蘭氏染色法

①原理

革蘭氏染色法是細(xì)菌學(xué)中廣泛使用的一種鑒別染色法。1884年由丹麥醫(yī)師Gram創(chuàng)立。

染色反應(yīng)呈藍(lán)紫色的稱為革蘭氏陽性細(xì)菌，用G+表示；

染色反應(yīng)呈紅色的稱為革蘭氏陰性細(xì)菌，用G―表示。

細(xì)菌對(duì)革蘭氏染色的不同反應(yīng)，是由于它們細(xì)胞壁的成分和結(jié)構(gòu)不同而造成的。

②細(xì)菌的革蘭氏染色步驟

涂片&#8594干燥&#8594固定&#8594初染&#8594水洗&#8594媒染&#8594水洗&#8594脫色&#8594水洗&#8594復(fù)染&#8594水洗&#8594干燥&#8594觀察

A）取培養(yǎng)物分別做涂片、干燥、固定，方法均與簡(jiǎn)單染色的相同；

B）用草酸銨結(jié)晶紫染色1min后水洗；

C）加碘液媒染1min后水洗；

D）斜置載玻片，滴加95％乙醇脫色，至流出的乙醇不現(xiàn)紫色為止，大約需時(shí)20～30s，隨即水洗；

E）用蕃紅染液復(fù)染30s，水洗；

F）用吸水紙吸掉水滴，待標(biāo)本片干后置顯微鏡下，用低倍鏡觀察，發(fā)現(xiàn)目的物后用油鏡觀察，注意細(xì)菌細(xì)胞的顏色。